CONTRIBUIÇÃO DO MECANISMO DE EFLUXO NA RESISTÊNCIA ÀS FLUOROQUINOLONAS EM ISOLADOS CLÍNICOS DE Klebsiella pneumoniae FORMADORES DE BIOFILME
Autor: Vanessa Radin (Currículo Lattes)
Resumo
Klebsiella pneumoniae é uma enterobactéria patogênica, sendo um dos principais agentes causadores de infecções do trato urinário (ITUs). Na forma de biofilme, é capaz de dificultar a difusão de diversas classes antimicrobianos (ATMs) aumentando sua resistência e favorecendo a recorrência destas infecções. O mecanismo de efluxo é considerado um dos fatores que pode contribuir para o aumento da resistência bacteriana devido sua capacidade de extrusão dos ATMs. No entanto, ainda é restrito o conhecimento da abrangência de sua participação, principalmente em comparação com as bactérias na forma planctônica, onde as bombas de efluxo também são ativas. Considerando a emergência de isolados de K. pneumoniae resistentes a múltiplos ATMs, incluindo as Fluorquinolonas (FQs) que são substratos das bombas de efluxo, o objetivo deste estudo foi avaliar a contribuição do mecanismo de efluxo na resistência a duas FQs em isolados clínicos de K. pneumoniae formadores de biofilme. Trata-se de um estudo analítico observacional, onde foram incluídos 23 isolados clínicos de K. pneumoniae provenientes de amostras de urina de pacientes atendidos no Hospital Universitário Dr. Miguel Riet Corrêa Jr, na cidade do Rio Grande – RS. A indução da formação de biofilme foi realizada através do método de aderência a microplacas. Enquanto que a determinação da concentração inibitória mínima de Ciprofloxacina (CIP) e Norfloxacina (NOR) frente as bactérias na forma planctônica foi realizada através do método de microdiluição em caldo. Para determinar a concentração inibitória mínima em biofilme (CIMB), foi realizada a indução da formação de biofilmes e posterior determinação da CIMB frente à CIP e NOR. Em paralelo, foi determinado e comparado o fator de modulação (FM) do inibidor de bomba de efluxo, Clorpromazina (CPZ), na atividade de CIP e NOR tanto em células planctônicas como em biofilme. A partir dos resultados obtidos, foram selecionados um isolado clínico sensível, um resistente e a cepa padrão ATCC 700603, os quais apresentaram diferentes comportamentos da forma planctônica para a forma de biofilme. A partir destes, foi realizado o ensaio de checkerboard para determinar a capacidade de inibição dos biofilmes através da combinação de CIP e NOR na presença de CPZ. Também foi realizado o ensaio de tolerância para verificar a contribuição do mecanismo de efluxo no desenvolvimento da tolerância em K. pneumoniae formadores de biofilme. Foram identificados 13 isolados clínicos formadores de biofilme, sendo Kp-9, Kp-15, Kp-24 e Kp-28 suscetíveis às FQs na forma planctônica e, na forma de biofilme, somente K-9 não foi suscetível. Em relação a atividade do efluxo, Kp-27 apresentou FM para ambas FQs e a cepa padrão ATCC 700603, apresentou atividade somente para NOR na forma planctônica. Em contrapartida, na forma de biofilme, Kp-20 e Kp21 apresentaram FM para ambas FQs e, Kp-9, Kp-10 e Kp-15 somente para CIP. Em relação ao checkerboard, foi observado que a interação de diferentes concentrações de FQs em combinação com as concentrações subinibitórias de CPZ apresentaram melhor potencial de inibição dos biofilmes. Por outro lado, foi identificado que as maiores concentrações de FQs em combinação com as concentrações subinibitórias de CPZ apresentaram decréscimo da inibição. Além disso, foi possível identificar no isolado Kp-27, que as menores concentrações de NOR em combinação com CPZ foram capazes de aumentar a inibição dos biofilmes de K. pneumoniae. Com relação aos ensaios de tolerância, foram observadas diferentes horas para atingir a tolerância entre os isolados clínicos e a cepa ATCC 700603. Também, foram observadas diferenças no tempo de tolerância entre às FQs. Para o isolado Kp-24, suscetível às FQs, o tempo de tolerância para CIP foi de quatro horas e para NOR, o tempo de tolerância foi equivalente à três horas. Enquanto que, para ATCC 700603 a tolerância para NOR foi anterior a uma hora testada e para CIP o tempo de tolerância foi obtido em quatro horas de ensaio. Já para o isolado Kp-27, o tempo de tolerância para ambas FQs foi inferior a uma hora de ensaio. Embora este estudo tenha demonstrado indiretamente que o mecanismo de efluxo foi capaz de contribuir para o aumento da resistência antimicrobiana de K. pneumoniae na forma de biofilme, ainda é necessária melhor compreensão deste mecanismo. Através da quantificação da expressão dos genes associados aos sistemas de efluxo (proteínas e reguladores trasncricionais) e a utilização de ferramentas de microscopia (varredura e confocal) será possível obter informações capazes de ampliar o entendimento da contribuição do mecanismo de efluxo na resistência em K. pneumoniae na forma de biofilme.
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