Análise genômica e estrutural na investigação do impacto de mutações na resistência antimicrobiana em isolados de Mycobacterium tuberculosis do sul do Brasil

Autor: Conrado Pizzolatto Castanho (Currículo Lattes)

Orientador: Profa. Dra. Karina dos Santos Machado

Resumo

A tuberculose permanece como um importante desafio em saúde pública, especialmente devido à persistência de casos resistentes e multidroga-resistentes. Nos útimos anos, o uso do sequenciamento total do genoma (Whole Genome Sequencing - WGS) e de ferramentas de genômica e bioinformática estrutural consolidou-se como uma estratégia central na investigação de mutações associadas à resistência antimicrobiana em Mycobacterium tuberculosis. Nesse contexto, este trabalho integrou dados genômicos, fenotípicos e análises estruturais para investigar 21 isolados clínicos provenientes do sul do Brasil, com ênfase na caracterização de variantes no gene katg, responsável pela ativação da isoniazida (INH). Inicialmente, realizou-se uma revisão integrativa da literatura com o objetivo de identificar os principais passos, ferramentas e parâmetros empregados na análise de WGS aplicada a M. tuberculosis. Como resultado dessa etapa, foram definidos diferentes fluxos de trabalho de acordo com o objetivo da análise genômica. A revisão evidenciou que ferramentas como FastQC, Trimmomatic, BWA-MEM, SAMtools, GATK, SnpEff e TB-Profiler constituem o núcleo metodológico mais frequentemente empregado em estudos conduzidos em diferentes regiões do mundo, corroborando a estratégia adotada nesta tese. Além disso, a literatura destacou a necessidade de padronização¸ ao dos fluxos de trabalho para análise genômica, especialmente em cenários de baixa infraestrutura, indicando que abordagens integrativas podem aumentar a confiabilidade diagnóstica e favorecer a vigilância molecular em regiões de alta carga da doença. Com base nessa revisão, definiu-se a sequencia de etapas de bioinformática aplicada às amostras: avaliação da qualidade dos arquivos fastq, mapeamento contra o genoma de referência H37Rv utilizando BWA-MEM, detecção de variantes por meio de duas ferramentas (SAMtools e GATK), com posterior identificação das variantes concordantes, e anotação funcional das mutações com SnpEff. Paralelamente, as amostras foram analisadas com o TB-Profiler para identificação de linhagem e perfil de resistência, permitindo a comparação direta com os resultados fenotípicos produzidos pelo NUPEMM/FURG. As 21 amostras apresentaram altas taxas de mapeamento (> 99%) e cobertura média superior a 100x, assegurando a confiabilidade na identificação¸ ao das variantes. A comparação¸ ao entre os dados genômicos e fenotípicos revelou mutações clássicas em genes associados à resistência a fármacos de primeira e segunda linha. Entretanto, duas variantes na proteína KatG foram selecionadas para caracterização estrutural: a mutação p.Ser315Asn (S315N), presente em quatro isolados e ainda pouco explorada do ponto de vista estrutural na literatura científica, e a mutação inédita p.Leu734Val (L734V), identificada em três isolados. Essa variante não consta em catálogos da Organização Mundial da Saúde nem na literatura científica e mostrou-se particularmente relevante, uma vez que os três isolados apresentaram resistência fenotípica à INH na ausência da mutação clássica S315T, configurando o principal achado deste estudo. As mutações na proteína KatG foram investigadas por meio de ferramentas de bioinformática estrutural, incluindo modelagem estrutural com o algoritmo AlphaFold3 e validação estereoquímica com o MolProbity. Os modelos gerados apresentaram escores compatíveis com estruturas de alta qualidade. Para aprofundar a compreensão do impacto dessas mutações na estrutura da proteína e em suas interações com o cofator HEME e com o fármaco isoniazida, foram realizadas simulações de dinâmica molecular (DM) de 200 ns para a KatG selvagem e para os mutantes. Os resultados da DM permitiram avaliar a estabilidade, a flexibilidade e o comportamento estrutural da proteína frente `as interações com o HEME e a INH. Embora a estabilidade global da proteína não tenha sido comprometida pelas mutações, foram observadas diferenças na região catalítica, sugerindo possíveis efeitos funcionais, especialmente para a variante p.Leu734Val. A localização dessa mutação, distante do sítio de ativação da INH e mais próxima da região C-terminal da proteína, indica um possível mecanismo de resistência alostérica. A integração das análises genômica, fenotípica e estrutural reforça que a mutação p.Leu734Val pode representar um mecanismo emergente de resistência à INH, destacando a necessidade de estudos complementares para avaliar seu impacto funcional. Os resultados obtidos demonstram a importância de pipelines bem estruturados para a análise de dados de WGS, especialmente quando integrados a métodos laboratoriais e abordagens de bioinformática estrutural. Assim, este trabalho contribui ao identificar uma mutação potencialmente relevante na KatG, ao demonstrar a consistência entre dados genômicos e fenotípicos no contexto regional e ao aplicar uma abordagem integrada que abrange desde o processamento dos dados brutos até a interpretação estrutural de proteínas. Os achados reforçam a necessidade contínua de vigilância genômica e de análises multidimensionais para orientar estratégias terapêuticas, aprimorar o diagnóstico e antecipar mecanismos emergentes de resistência em M. tuberculosis.

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